2.3.2.2.1 Theorie zur Gelelektrophorese von DNA
Die Gelelektrophorese dient der Auftrennung von DNA-Molekülen unterschiedlicher Größe und Konfiguration. Unter Elektrophorese versteht man die Bewegung geladener Teilchen in einem Medium unter Einfluß eines elektrischen Felds. Ein solches elektrisches Feld wird durch Anlegen von Spannung an ein Elektrolyt, also den Elektrophoresepuffer, erzeugt. Aufgrund der durch die Phosphatreste vermittelten negativen Ladung der DNA bewegt sich diese in einem elektrischen Feld von der Kathode zur Anode. Da auch DNA-Moleküle unterschiedlicher Größe die gleiche Ladungsdichte aufweisen, würden sie in freier Lösung in einem elektrischen Feld gleich schnell laufen. Um eine Auftrennung verschiedener DNA-Moleküle zu erreichen, wird die Elektrophorese in porösen Matrizen durchgeführt, die als Molekularsiebe dienen. Sie bestehen hier aus
- Agarose und
- Bei Agarose handelt es sich um ein Polymer aus β-D-Galactose und 3,6-Anhydro-α-L-Galactose (Agarobiose). Dabei biulden sich Doppelhelizes, die sich zu Aggregaten zusammenlagern. Die Porengröße wird durch die Agarosekonzentration variiert (0,3 – 2 %), wobei die Porengröße mit steigender Konzentration sinkt. In diesem Konzentrationsbereich der Agarose können DNA-Fragmente von ca. 70 bp bis zu etwa 50 kbp[1] aufgetrennt werden, wobei die Trennschärfe bei etwa 0,5 der absoluten Fragmentgröße liegt, d. h. daß z. B. Fragmente von 1.000 bzw. 1.050 bp getrennt dargestellt werden.
- Polyacrylamid (PAA).
- PAA wird aus einem Gemisch aus Acrylamid und N,N’-Methylendiacrylamid, in dem die Moleküle miteinander vernetzt sind, hergestellt. Die Porengröße wird durch die PAA-Konzentration (3 – 20 %) und den Vernetzungsgrad bestimmt. Die Auftrennung erfolgt abhängig von der PAA-Konzentration in einem Bereich von 1 bis ca. 1.000 bp.
Die Wahl der Matrizen ist bei der Gelelektrophorese abhängig von der Größe der DNA-Fragmente, die aufgetrennt werden sollen.
Vor der elektrophoretischen Auftrennung von DNA wird diese mit einem sog. Farbmarker (Färbemittel) versetzt. Hierbei kommen v. a. Bromphenolblau und Xylencyanol zum Einsatz. Beide sind blaue Farbstoffe, deren Laufverhalten in Gelen unterschiedlicher Porengröße bekannt ist: Während Bromphenolblau in einem 1 %igen Agarosegel wie DNA-Fragmente von etwa 600 bp Länge wandert, wandert Xylencyanol unter gleichen Voraussetzungen ca. 3.000 bp weit. Sie dienen während des Gellaufs als Anhaltspunkt, wie weit die DNA-Fragmente in einem Gel bereits aufgetrennt sind.
Neben dem Farbstoff und der DNA wird noch Glycerin in die Proben gegeben. Es hat eine höhere Dichte als Wasser, so daß die DNA-Probe schwerer ist als der Elektrophoresepuffer und beim Beladen des Gels in die Taschen absinkt. Bei der Elektrophorese erfolgt also eine Auftrennung der DNA-Moleküle nach ihrer Länge in Basenpaaren. Dies wird sowohl für ganze, ungespaltene DNA (lineare oder ringförmige DNA, z. B. PhagenDNA, Plasmid-DNA, chromosomale DNA) als auch für die Auftrennung gespaltener DNA-Fragmente, wie sie in typischer Weise nach DNA-Spaltung (Verdauung) mit Restriktionsenzymen entstehen (Restriktionsanalyse), ausgenutzt.
Bei ungespaltenen DNA-Ringen (z. B. Plasmid-DNA) erfolgt außerdem eine Auftrennung nach der Größe und Konfiguration. In der Zelle liegt die ringförmige DNA i. d. R. als ccc-Form (circular covalently closed; kovalent geschlossen) vor. Durch physikalische Kräfte (z. B. Scherkräfte) wird bei der Präparation ein gewisser Anteil an oc- (open circle; offene Ringform) oder evtl. sogar linearisierter DNA gebildet.
Nach der elektrophoretischen Auftrennung wird die DNA in der Gelmatrix optisch nachgewiesen. Die DNA-Färbung erfolgt mit Ethidiumbromid (EtBr), welches aufgrund seiner planaren Struktur zwischen den Basen der DNA interkaliert. Bei Bestrahlung mit UV-Licht fluoresziert Ethidiumbromid im sichbaren Bereich rosa bis lila, so daß die aufgetrennte DNA bei Auflage des gefärbten Gels unter eine UV-Lampe als rosa bis lila Banden sichtbar wird. Durch Anfärben mit Ethidiumbromid kann eine DNA-Menge von 5 ng in einem Gel noch sichtbar gemacht werden. Während sich bei der Ethidiumbromid-Färbung im Gelbild weiße Banden auf schwarzem Grund zeigen, sind bei der Färbung mit dem blauen Farbstoff Azu-B-chlorid, der alternativ verwendet wird, im Gelbild schwarze Banden auf hellem Grund zu sehen.
[1]: kbp: kilo base pairs; 1.000 Basenpaare
