3.10.1 Reinigung
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II. Molekularbiologie
3.0 Aminosäuren (α-Aminocarbonsäuren) und Proteine
3.10 Reinigung, Charakterisierung und Lagerung von Proteinen
3.10.1 Reinigung
Zur Trennung von Proteinen aus einem Gemisch werden ihre unterschiedlichen Eigenschaften in Lösung wie Molekülgröße, elektrische Ladung, Löslichkeit und ihre biologische Affinität zu anderen Molekülen ausgenutzt. Ausgangspunkt ist die Vermehrung von Zellen, aus denen ein bestimmtes Protein, das sich entweder in der Zelle befindet oder von den Zellen in die Nährlösung ausgeschieden wurde, gewonnen werden soll.
Die Proteinisolierung beginnt dann meist mit einer Trennung der Größe, d. h. es werden kleinere, nichtproteinogene Moleküle abgetrennt. Hierbei gibt es mehrere Möglichkeiten:
- Bei der Dialyse werden die Moleküle z. B. mit einer semipermeablen Membran aus Cellophan (Celluloseacetat) oder anderen Cellulosederivaten separiert.
- Eine weitere Möglichkeit der Trennung stellt die sog. Ultrafiltration dar, bei der die Proteinlösung durch einen Membranfilter mit einer bestimmten Porengröße gepreßt oder von unten mit einem Vakuum gesaugt wird. Auf diese Art und Weise können auch ganz kleine Proteine abgeschieden werden.
- Die letzte häufig angewandte Möglichkeit wird als Dichtegradientenzentrifugation bezeichnet. Dabei werden in einem Zentrifugenröhrchen unterschiedlich stark konzentrierte Lösungen von Saccharose vorsichtig so aufeinander geschichtet, daß am Grund des Gefäßes die höchste Dichte bzw. Konzentration vorhanden ist und diese nach oben hin absinkt. Nach dem Auftragen der Proteinlösung und hochtouriger Zentrifugation im Horizontalrotor sammeln sich die verschiedenen Proteine jeweils in der Schicht, die ihrer Dichte entspricht. Es folgt im Anschluß das Anstechen der unterschiedlichen Schichten und ihr Abziehen. Anschließend wird zur Entfernung der Saccharose eine Dialyse durchgeführt.
Im weiteren Verlauf erfolgt eine weitere Auftrennung der Proteine nach z. B. Ladung oder Löslichkeit. Dabei fallen jeweils unterschiedlichen Fraktionen an, mit denen eine Bestimmung der vorhandenen Proteinkonzentration (z. B. nach BRADFORD 1976) oder ein geeigneter Aktivitätstest[1] für das gesuchte Protein durch ein spezielles Enzym.
Typischerweise wird im Verlauf der Proteinaufreinigung die Proteinmenge durch Verluste abnehmen und die spezifische Aktivität zunehmen, da die Fraktionen verworfen werden, die nur wenig oder keine von den gesuchten Proteinen enthalten. Unter den ersten Trennschritten werden jetzt z. B. isoelektrische Fällung (Präzipation) oder das Aussalzen (z. B. mit Ammoniumsulfat) sein. Bei der isoelektrischen Fällung wird die Eigenschaft von Proteinen genutzt, daß diese am pI (zusammen mit einigen anderen Wenigen, die den gleichen oder sehr ähnlichen pI haben) ausfallen. Die endgültige Isolierung erfolgt dann durch Abzentrifugieren und Resuspendieren in Puffer mit geeignetem pH-Wert. Beim Aussalzen wird die Eigenschaft ausgenutzt, daß bei hoher Ionenstärke die Löslichkeit der Proteinmoleküle als Ergebnis der Konkurrenz zwischen den zugegebenen Salzionen und den Proteinen um die H2O-Moleküle der Hydrathüllen sinkt und dadurch den Proteinen die Hydrathülle entzogen wird. Dadurch kommt es zur Anziehung positiver und negativer Ladungen benachbarter Moleküle und zur Bildung unlöslicher Aggregate, die ausfallen. Da die Ionen von divalenten Salzen (z. B. (NH4)2SO4) aufgrund ihrer hohen Ionenstärke wirksamer als monovalente Salze (z. B. NaCl) sind, werden sie beim Aussalzen bevorzugt verwendet. Das Aussalzen geschieht häufig mit (NH4)2SO4, da seine sehr gute Wasserlöslichkeit (4
bei 0 °C) hohe Ionenstärken ermöglicht. Durch (NH4)2SO4-Zugabe wird nacheinander die Konzentration erhöht. Der jeweils gefällte Proteinteil wird nach Zentrifugation im Puffer resuspendiert, dialysiert (um restliches Salz zu entfernen) und auf vorhandene Proteinkonzentration sowie seine biologische Aktivität getestet.
An die Fällung schließen meist chromatographische Methoden an, wobei Gelausschlußchromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder (wenn möglich) eine Affinitätschromatographie bevorzugt durchgeführt werden.
[1]: Die Aktivität eines Enzyms ist die Enzymmenge, die bei optimalen Reaktionsbedingungen 1 µmol Substrat pro Minute umsetzt. Die Enzymaktivität wird in Enzymeinheiten u angegeben.
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