2.3.3 Tricks in der Gentechnik

Von außerhalb kann fremde DNA auf verschiedene Weisen in eine Bakterienzelle gelangen:

• Einbau von Fragmenten mit glatten Enden in ein Vektorplasmid:

• Aufschneiden des Vektorplasmids mit einem blunt end-Restriktionsenzym, z. B. Sma I.
• Fremd-DNA-Fragmente liegen ebenfalls miot glatten Enden vor, z. B. nach

• cDNA-Synthese,
• künstlicher Synthese von Oligonukleotiden oder
• Spaltung der Fremd-DNA mit einem blunt ends-Enzym.

• Anknüpfen geeigneter überstehender Enden an die jeweiligen 3’-Enden mit terminalen Transferasen, z. B. viele G beim Vektor und viele C bei der Fremd-DNA. Auf diese Weise lassen sich auch künstlich synthetisierte Oligonukleotid-Doppelstränge, z. B. multicloning sites, in ein Plasmid einfügen. Die Methode zum künstlichen Anhängen geeigneter Schwänze wird Tailing genannt.

• Fragmente einer mit einem sticky ends-Restriktionsenzym verdauten Fremd-DNA haben identische überstehende Enden. Solche Fragmente können sich in zwei unterschiedlichen Orientierungen in das Vektorplasmid einfügen (aber es ist nur in einer Orientierung eine richtige Übersetzung möglich). Deshlab wird eine Doppelverdauung von Vektor und fremd-DNA mit zwei verschiedenen sticky ends-Restriktionsenzymen durchgeführt. Die Basenabfolge im Bereich des Gens einschließlich der Schnittstellen muß bekannt sein, um die Restriktionsenzyme richtig zu wählen, da sonst nicht bei allen Fragmenten die geeigneten Enden zum Einbau vorhanden sind. Dies erhöht zugleich auch etwas die Chance für den Einbau des gesuchten Gens.
• Deutliche Erhöhung der Wahrscheinlichkeit für den Einbau des gewünschten Gens durch Amplifizierung mittels PCR:

Die Voraussetzung hierfür ist, daß eine Basenabfolge im Bereich des Gens einschließlich der Schnittstellen bekannt sein muß. Benötigt werden Ausgangsfragmente, die das Gen mitsamt den später verwendeten Schnittstellen enthalten (am besten synthetisch hergestellt). Dabei müssen die Primer zu der Basenabfolge vor der jeweiligen Erkennungssequenz in 3' → 5'-Richtung passen. Nach der PCR erfolgt eine Spaltung mit den beiden Restriktionsenzymen, welche die gewünschten Enden für den Einbau des Fragments mit dem Gen liefert.

• Eine Einschränkung der Religierung des Vektorplasmids ist durch Verwendung von Alkalischer Phosphatase (AP) möglich. Diese spaltet vom 5'-Ende einer DNA freie Phosphatgruppen ab (wird nur beim Vektorplasmid angewandt). Dadurch ist erst durch Zugabe von ATP, welches den fehlenden Phosphatrest an Basen liefert, eine endgültige Verknüpfung möglich.