2.3.3.2.5 Plasmidisolierung aus E. coli

Gegenwärtig werden Plasmide verstärkt durch Schnellverfahren aus 1 – 4 ml-Kulturen gewonnen, sog. mini preps. Die gewonnene Plasmid-DNA kann i. d. R. anschließend sofort für molekularbiologische Untersuchungen verwendet werden. Zwei wichtige Verfahren sind die sog.

• STET-Lyse und

Bei der STET-Lyse wird die Membran durch das milde Detergenz Triton X in Kombination mit EDTA (fängt die für die Membranstabilität erforderlichen Mg²⁺-Ionen ab) und Lysozym (spaltet die Mureinketten der Zellwand) so schonend geöffnet, daß nur die Plasmid-DNA frei wird, während die chromosomale DNA noch an der Membran befestigt bleibt. Membrantrümmer und chromosomale DNA werden anschließend abzentrifugiert. Aus dem Überstand wird die Plasmid-DNA mit Isopropanol ausgefällt (entzieht die Hydrathülle), mit Ethanol gewaschen und in geeignetem Puffer resuspendiert.

• alkylische Lyse (wird häufiger durchgeführt).

Bei der alkylischen Lyse erfolgen Zellaufschluß und Ausfällen der chromosomalen DNA mit Hilfe von NaOH und SDS (Natriumdodecylsulfat). Dabei werden sowohl die chromosomale DNA wie auch die Plasmid-DNA freigesetzt und gleichzeitig total denaturiert (werden unlöslich). Bei der anschließenden Neutralisation mit Kaliumacetat renaturiert die Plasmid-DNA wesentlich schneller (wird wieder löslich) als die ausgefällte chromosomale DNA und befindet sich nach Abzentrifugieren der chromosomalen DNA im Überstand. In Gegenwart hoher Salzkonzentrationen wird die Plasmid-DNA an ein kleines Glasfaservlies oder eine kleine Chromatographiesäule spezifisch gebunden (während sonstige zelluläre Verbindungen durchlaufen). Durch Wechsel auf niedrige Salzkonzentration im Puffer kann die Plasmid-DNA anschließend mehr oder weniger rein von der Säule bzw. vom Vlies in gelöster Form eluiert werden.