2.3.3.2.2 Herstellung radioaktiv markierter Gensonden
Die hauptsächlich angewandte Methode der Markierung ist die nick translation. Dabei wird zunächst von doppelsträngiger DNA mit der gesuchten Basenabfolge ausgegangen:
Zunächst wird durch eine limitierte Behandlung mit DNAse ein Einzelstrangbruch (nick) herbeigeführt. Dabei entsteht durchschnittlich ein nick pro DNA-Molekül. Dann werden DNA-Polymerase I und die vier Sorten der DNA-Nukleotide zugegeben, wobei eine Nukleotidsorte radioaktiv markiert ist.
Generell besitzen DNA-Polymerasen drei Enzymaktivitäten:
- eigentliche Polymerase (braucht einen Primer und verdoppelt von 5' → 3')
- 5' → 3'-Exonuclease (baut DNA-Stränge mit einem freien Ende von 5' → 3' ab)
- 3' → 5'-Exonuclease (baut DNA-Stränge mit einem freien Ende von 3' → 5' ab)
Die 5' → 3'-Exonuclease baut vom 5'-Ende her den unteren Strang ab und die DNA-Polymerase verlängert jeweils den DNA-Strang hinter dem nick komplementär zum oberen Strang. Dabei werden an bestimmten Stellen auch die radioaktiven Nukleotide eingebaut. Nach der Denaturierung und dem Abtrennen des radioaktiv markiertern Strangs liegt die einzelsträngige Gensonde vor.
