3.10.1.2 Ionenaustauschchromatographie

Häufig folgt auf die Fällung und Dialyse eine Trennung des verbliebenen Proteingemischs über eine Ionenaustauschsäule, die Ionenaustauscher (Ionentauscher) enthält. Das Eluat wird in Fraktionen aufgefangen.

Der Ionenaustauscher besteht aus einem festen Material, an dem kovalent geladene Gruppen gekoppelt sind. Als Material werden künstliche Harze, z. B. Polystyrol, oder (in den meisten Fällen) Cellulose oder Derivate davon verwendet. Auch Gele aus Agarose oder Polyacrylamid sind möglich. Es können folgende Ionenaustauscher unterschieden werden:

• Kationenaustauscher

Sie enthalten in wäßriger Lösung negativ geladene Gruppen (z. B. Carboxymethylcellulose mit Carboxymethylrest, Phosphocellulose mit Phosphatrest, Dowex 50 mit einem Sulfansäurerest an Polystyrol, etc.). Nach dem Äquilibrieren des Säulenmaterials mit dem einem pH und Salzkonzentration geeigneten Puffer binden zunächst die in ihm enthaltenen Kationen (z. B. Na⁺ oder H₃O⁺) an die geladenen Gruppen. Sie werden nach dem Auftragen der Proteinlösung durch die vorhandenen Proteinkationen verdrängt. Je stärker positiv das Protein geladen ist, desto stärker bindet es an das Säulenmaterial. Negativ geladene Proteine laufen mit dem Puffer ohne an ihn zu binden durch die Säule.

• Anionenaustauscher

Anionenaustauscher enthalten in wäßriger Lösung positiv geladene Gruppen. Es handelt sich dabei i. d. R. um tertiäre Amine oder ihre Derivate (mit 4-bindigen N-Atomen), z. B. Diethylaminoethylcellulose (DEAE-Cellulose). Nach dem Äquilibrieren des Säulenmaterials mit dem geeigneten Puffer binden zunächst die im Puffer enthaltenen Anionen (z. B. Cl^- oder OH^-) an die geladenen Gruppen. Sie werden nach dem Auftragen der Proteinlösung durch die vorhandenen Proteinanionen verdrängt. Je stärker negativ ein Protein geladen ist, umso stärker bindet es an das Säulenmaterial. Positiv geladene Proteine laufen auch hier mit dem Puffer ohne an ihn zu binden durch die Säule.

Anschließend wird die Säule mit dem Elutionspuffer gespült. Durch kontinuierliche Änderung des pH-Werts oder aber der Salzkonzentration des Elutionspuffers erfolgt das Ablösen (Eluieren) der gebundenen Proteinmoleküle in der Reihenfolge ihrer Bindungsstärke (die schwach gebundenen Proteine zuerst).

Oft erfolgt die eigentliche Chromatographie durch kontinuierliche Erhöhung (bei Verwendung eines Kationenaustauschers) oder Verringerung des pH-Werts (bei Anionenaustauschern) des Puffers, mit dem das Säulenmaterial nach dem Auftragen der Probe gespült wird[1]. Häufiger erfolgt sie jedoch durch kontinuierliche Erhöhung der Salzkonzentration im Spülpuffer[2]. Im technischen Betrieb wird entweder mit unterschiedlichen Puffern (mit unterschiedlichem pH oder verschiedenen Salzkonzentrationen) gespült oder (häufiger) durch sog. Gradienteneluation mit Hilfe eines Gradientenmischers. Meist liegt ein linearer Gradient vor, bei dem dann die Salzkonzentration kontinuierlich linear erhöht bzw. der pH-Wert linear verändert wird. Es sind jedoch auch konkave oder konvexe Gradienten möglich. Sowohl konkave[3] als auch konvexe[4] Gradienten sind nützlich, um in einem bestimmten Bereich nahezu gleich stark geladene Proteine trennen zu können.

Während des Eluierens wird das aus der Säule austretende Eluat in Fraktionen gesammelt. Der zugehörige Fraktionssammler fängt je nach Einstellung eine bestimmte Zeit lang oder ein bestimmtes Volumen auf. Die einzelnen Fraktionen werden wieder auf ihre Aktivität und ihren Proteingehalt getestet. Bei modernen Chromatographie-Apparaturen, sog. Chromatographen, läuft das Eluat an einem UV-Detektor vorbei, der kontinuierlich die Lichtabsorption bei 280 nm, die direkt proportional zur jeweiligen Proteinkonzentration ist, mißt und mit einem Schreiber am oder einem PC verbunden ist. Die Fraktion(en) mit der höchsten Aktivität wird weiter verarbeitet.

Im Anschluß an die Ionenaustauschchromatographie kann eine Gelfiltration durchgeführt werden. Als sehr effektiv erweist sich eine Methode, bei der die Trennung durch Ionenaustausch und Proteingröße in einem einzigen Ionenaustauscher kombiniert wird. Dazu werden Sephadexpartikel verwendet, die ansynthetisierte DEAE- (DEAE-Sephadex) oder CM[5]-Gruppen (CM-Sephadex) tragen.

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[1]: Die Änderung des pH-Werts verändert die Ladung der gebundenen Proteine.

[2]: Die zahlreichen Ladungsträger verdrängen dann wiederum die Proteine vom Säulenmaterial.

[3]: Zunächst erfolgt eine kleine Änderung der Salzkonzentration, die mit der Zeit immer größer wird.

[4]: Hier erfolgt zunächst eine große Änderung der Salzkonzentration, die dann mit der Zeit immer weiter abflacht und sich asymptotisch einem Wert nähert.

[5]: Carboxymethyl