2.3.1.1 Anwendung und Durchführung
Die PCR dient zum Nachweis eines bestimmtes Gens. Dabei wird wie folgt vorgegangen:
- 1. Isolierung der DNA aus dem zu untersuchenden Gewebe
- 2. Spalten der DNA in kürzere doppelsträngige Fragmente mit Hilfe eines Restriktionsenzyms.
Nach diesem Schritt befinden sich viele unterschiedlich lange DNA-Fragmente im Untersuchungsgefäß.
- 3. Zugabe von spezifischen Primern
- 4. Zugabe von DNA-Polymerase
- 5. Zugabe von Nukleotiden
Die beiden verwendeten Primer-Sorten sind komplementär zur Basenabfolge vor bzw. hinter den gesuchten Genen. Bevor die Primer binden können, muß der entsprechende DNA-Doppelstrang in zwei Einzelstränge getrennt werden. Die geschieht während der sog. Denaturierung bei 90 – 95 °C.
Jetzt erfolgt die Bindung der Primer an die Einzelstränge (Annealing) bei 50 – 60 °C.
Bei der sog. Extension werden die Primer bis zum Ende des komplementären Gegenstranges verlängert. Dieser Schritt erfolgt beim Temeraturoptimum der verwendeten DNA-Polymerase, z. B. bei der Taq-Polymerase[1] bei 72 – 74 °C.
Nun ist der 1. Zyklus beendet. Da die Primer nur zudem Bereich vor dem gesuchten Gen passen, wird auch nur das Fragment, das das Gen enthält, vervielfältigt. Grundvoraussetzung ist daher, daß die Basenabfolge in diesem Bereich bekannt sein muß. Da die Primerlänge 15 bis 25 bp beträgt, ist es relativ unwahrscheinlich, daß die passende Basenabfolge noch vor einem anderen Gen liegt. Die Zahl der Zyklen, die durchgeführt werden (müssen), ist von der vorhandenen DNA-Menge abhängig. I. d. R. sind das 25 – 45 Zyklen. Die Abhängigkeit der Zahl der genhaltigen Fragmente (mit dem gesuchten Gen) von der Anzahl der Zyklen lautet:
mit
- y: Zahl der genhaltigen Fragmente
- x: Zahl der durchgeführten Zyklen
[1]: Die Taq-Polymerase stammt aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus. Sie geht bei der Denaturierung nicht kaputt. Dadurch ist eine Automatisierung der PCR in einem sog. Thermocycler möglich.
