2.3.2.3.1 Gewünschte Eigenschaften von Plasmidvektoren: Unterschied zwischen den Versionen

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Bei der Genklonierung sind für die Vektorplasmide folgende Eigenschaften erwünscht:
 
Bei der Genklonierung sind für die Vektorplasmide folgende Eigenschaften erwünscht:
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*Sie sollten möglichst klein (zwischen 2.000 und 6.000 bp) sein, damit sie besser von den Wirtszellen aufgenommen werden können.
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*Sie sollten '''möglichst klein''' (zwischen 2.000 und 6.000 bp) sein, damit sie besser von den Wirtszellen aufgenommen werden können.
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• Das Plasmid muß vor jeder Zellteilung repliziert werden. Die benötigten Enzyme bzw. Proteine können von der chromosomalen DNA codiert werden. Dafür braucht das Plasmid mindestens einen eigenen Startpunkt (ori) der Replikation (1 – 10 Plasmidkopien pro Zelle; single copy-Plasmid).
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*Das Plasmid muß '''vor jeder Zellteilung repliziert''' werden. Die benötigten Enzyme bzw. Proteine können von der chromosomalen DNA codiert werden. Dafür braucht das Plasmid mindestens einen eigenen Startpunkt (ori) der Replikation (1 – 10 Plasmidkopien pro Zelle; '''single copy-Plasmid''').
  
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:::Es ist oft besser, wenn das Plasmid die kompletten Gene (+ ori) für seine Replikation selber hat, weil dann mehr Genprodukte möglich sind (bis zu 1.000 Plasmidkopien pro Zelle; multi copy-Plasmid). Dies ist jedoch nur sinnvoll, wenn größere Mengen des gebildeten Proteins die Wirtszelle nicht schädigen!
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:::Es ist oft besser, wenn das Plasmid die kompletten Gene (+ ori) für seine Replikation selber hat, weil dann mehr Genprodukte möglich sind (bis zu 1.000 Plasmidkopien pro Zelle; '''multi copy-Plasmid'''). Dies ist jedoch nur sinnvoll, wenn größere Mengen des gebildeten Proteins die Wirtszelle nicht schädigen!
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*Das Plasmid sollte ein Antibiotika-Resistenzgen zum Test, ob die Wirtzelle ein Plasmid aufgenommen hat, sowie eine zweite genetische Markierung zum Test, ob die Wirtszelle ein religiertes oder rekombinantes Plasmid aufgenommen hat, z. B. ein zweites Antibiotika-Resistenzgen bei pBr- und pACYC-Plasmiden oder das lac z-Gen (für Galactosidase beim Lactose-Abbau) bei pUC-Plasmiden, haben. Dieses zweite Markergen wird durch den Einbau der fremden DNA zerstört (Insertionsinaktivierung).
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*Das Plasmid sollte ein '''Antibiotika-Resistenzgen''' zum Test, ob die Wirtzelle ein '''Plasmid aufgenommen''' hat, sowie eine zweite genetische Markierung zum Test, ob die Wirtszelle ein '''religiertes oder rekombinantes Plasmid''' aufgenommen hat, z. B. ein zweites Antibiotika-Resistenzgen bei pBr- und pACYC-Plasmiden oder das lac z-Gen (für Galactosidase beim Lactose-Abbau) bei pUC-Plasmiden, haben. Dieses zweite Markergen wird durch den Einbau der fremden DNA zerstört (Insertionsinaktivierung).
 
:::<div align=center>[[Bild:Insertionsinaktivierung.jpg]]</div>
 
:::<div align=center>[[Bild:Insertionsinaktivierung.jpg]]</div>
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*Außerdem sollte das Plasmid singuläre Schnittstellen für möglichst viele Restriktionsenzyme besitzen. Die singuläre Schnittstelle muß in dem zweiten Markergen liegen, das durch den Einbau der Fremd-DNA zerstört wird. Sie darf nicht im ori oder einem anderen für die Replikation, Transkription oder Translation wichtigen Basenabfolge liegen. Oftmals enthalten Vektorplasmide sogar eine multicloning site, d. h. innerhalb eines Markergens eine künstlich eingefügte Basenabfolge, die zahlreiche singuläre Schnittstellen enthält.
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*Außerdem sollte das Plasmid '''singuläre'''[1] '''Schnittstellen''' für möglichst viele[2] Restriktionsenzyme besitzen. Die singuläre Schnittstelle muß in dem zweiten Markergen liegen, das durch den Einbau der Fremd-DNA zerstört wird. Sie darf nicht im ori oder einem anderen für die Replikation, Transkription oder Translation wichtigen Basenabfolge liegen. Oftmals enthalten Vektorplasmide sogar eine '''multicloning site''', d. h. innerhalb eines Markergens eine künstlich eingefügte Basenabfolge, die zahlreiche singuläre Schnittstellen enthält.
  
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Nach der Spaltung von Vektor- und Fremd-DNA, Vereinigung und Ligation werden die DNA-Stücke mit geeigneten Wirtszellen gemischt (Transformation), wobei es je nach Anwendung mehrere Möglichkeiten gibt.
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Nach der Spaltung von Vektor- und Fremd-DNA, Vereinigung und Ligation[3] werden die DNA-Stücke mit geeigneten Wirtszellen gemischt (Transformation), wobei es je nach Anwendung mehrere Möglichkeiten gibt.
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<div align=center>
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{|border=1 style="text-align:center"
 +
|Plasmid
 +
|Größe (in kbp)
 +
|genetische Marker
 +
|Klonierungsstellen
 +
|Änderungen im Phänotyp
 +
|-
 +
|pSC 101
 +
|9,1
 +
|Tc<sup>r</sup>
 +
|Eco R I
 +
|keine
 +
|-
 +
|pBR 322
 +
|4,4
 +
|Ap<sup>r</sup>, Tc<sup>r</sup>
 +
|Eco R I, Ava I, Pvu II, Pst I, Pvu I, Sca I, Cla I, Eco R V, Bam H I, Sa III
 +
|keine, ampicillinsensitiv, tetracyclinsensitiv
 +
|-
 +
|pBR 327
 +
|3,3
 +
|Ap<sup>r</sup>, Tc<sup>r</sup>
 +
|identisch mit  pBR 322
 +
|identisch mit pBR 322
 +
|-
 +
|pBR 325
 +
|5,4
 +
|Ap<sup>r</sup>, Cm<sup>r</sup>, Tc<sup>r</sup>
 +
|Ba II, Ava I, Pvu II, Eco R I
 +
|keine, chloramphenicolsensitiv
 +
|-
 +
|pBR 328
 +
|identisch mit pBR 325
 +
|identisch mit pBR 325
 +
|identisch mit pBR 325
 +
|identisch mit pBR 325
 +
|-
 +
|pACYC 177
 +
|3,9
 +
|Ap<sup>r</sup>, Km<sup>r</sup>
 +
|Pst I, Hinc II, Scal I, Hind III, Sma I, Cla I
 +
|ampicillinsensitiv, kanamycinsensitiv
 +
|-
 +
|pACYC 184
 +
|4,2
 +
|Cm<sup>r</sup>, Tc<sup>r</sup>
 +
|Hind III, Cla I, Eco R V, Bam H I, Eco R I, Neo I, Sca I
 +
|chloramphenicolsensitiv, tetracyclinsensitiv
 +
|-
 +
|pUC 19
 +
|2,7
 +
|Ap<sup>r</sup>
 +
|Polylinker
 +
|lac-negativ
 +
|}</div>
 +
<small>'''Tab. 17: Genetische Marker bei der Genklonierung'''</small>
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<small>[1]: Das Plasmid soll sich nach der Insertion wieder zum Ring schließen.
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[2]: zur besseren Auswahl
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[3]: syn. Ligieren; endgültige Verknüpfung durch DNA-Ligase</small>

Aktuelle Version vom 21. November 2008, 20:56 Uhr

Bei der Genklonierung sind für die Vektorplasmide folgende Eigenschaften erwünscht:

  • Sie sollten möglichst klein (zwischen 2.000 und 6.000 bp) sein, damit sie besser von den Wirtszellen aufgenommen werden können.
  • Das Plasmid muß vor jeder Zellteilung repliziert werden. Die benötigten Enzyme bzw. Proteine können von der chromosomalen DNA codiert werden. Dafür braucht das Plasmid mindestens einen eigenen Startpunkt (ori) der Replikation (1 – 10 Plasmidkopien pro Zelle; single copy-Plasmid).
Es ist oft besser, wenn das Plasmid die kompletten Gene (+ ori) für seine Replikation selber hat, weil dann mehr Genprodukte möglich sind (bis zu 1.000 Plasmidkopien pro Zelle; multi copy-Plasmid). Dies ist jedoch nur sinnvoll, wenn größere Mengen des gebildeten Proteins die Wirtszelle nicht schädigen!
  • Das Plasmid sollte ein Antibiotika-Resistenzgen zum Test, ob die Wirtzelle ein Plasmid aufgenommen hat, sowie eine zweite genetische Markierung zum Test, ob die Wirtszelle ein religiertes oder rekombinantes Plasmid aufgenommen hat, z. B. ein zweites Antibiotika-Resistenzgen bei pBr- und pACYC-Plasmiden oder das lac z-Gen (für Galactosidase beim Lactose-Abbau) bei pUC-Plasmiden, haben. Dieses zweite Markergen wird durch den Einbau der fremden DNA zerstört (Insertionsinaktivierung).
Fehler beim Erstellen des Vorschaubildes: Die Miniaturansicht konnte nicht am vorgesehenen Ort gespeichert werden
  • Außerdem sollte das Plasmid singuläre[1] Schnittstellen für möglichst viele[2] Restriktionsenzyme besitzen. Die singuläre Schnittstelle muß in dem zweiten Markergen liegen, das durch den Einbau der Fremd-DNA zerstört wird. Sie darf nicht im ori oder einem anderen für die Replikation, Transkription oder Translation wichtigen Basenabfolge liegen. Oftmals enthalten Vektorplasmide sogar eine multicloning site, d. h. innerhalb eines Markergens eine künstlich eingefügte Basenabfolge, die zahlreiche singuläre Schnittstellen enthält.

Nach der Spaltung von Vektor- und Fremd-DNA, Vereinigung und Ligation[3] werden die DNA-Stücke mit geeigneten Wirtszellen gemischt (Transformation), wobei es je nach Anwendung mehrere Möglichkeiten gibt.

Plasmid Größe (in kbp) genetische Marker Klonierungsstellen Änderungen im Phänotyp
pSC 101 9,1 Tcr Eco R I keine
pBR 322 4,4 Apr, Tcr Eco R I, Ava I, Pvu II, Pst I, Pvu I, Sca I, Cla I, Eco R V, Bam H I, Sa III keine, ampicillinsensitiv, tetracyclinsensitiv
pBR 327 3,3 Apr, Tcr identisch mit pBR 322 identisch mit pBR 322
pBR 325 5,4 Apr, Cmr, Tcr Ba II, Ava I, Pvu II, Eco R I keine, chloramphenicolsensitiv
pBR 328 identisch mit pBR 325 identisch mit pBR 325 identisch mit pBR 325 identisch mit pBR 325
pACYC 177 3,9 Apr, Kmr Pst I, Hinc II, Scal I, Hind III, Sma I, Cla I ampicillinsensitiv, kanamycinsensitiv
pACYC 184 4,2 Cmr, Tcr Hind III, Cla I, Eco R V, Bam H I, Eco R I, Neo I, Sca I chloramphenicolsensitiv, tetracyclinsensitiv
pUC 19 2,7 Apr Polylinker lac-negativ

Tab. 17: Genetische Marker bei der Genklonierung

[1]: Das Plasmid soll sich nach der Insertion wieder zum Ring schließen.

[2]: zur besseren Auswahl

[3]: syn. Ligieren; endgültige Verknüpfung durch DNA-Ligase

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